名称	20 T	50 T
1、吸附柱	20个	50个
2、网络管	20个	50个
3、裂解液	5 mL	11 mL
4、洗液I	13 mL	32 mL
5,洗液II	13 mL	32 mL
6.洗脱液	1.2 mL	3 mL

　　2、保留前提及有效期：室温下保留，有效期12个月.

　　3、需自备资料：无水乙醇、1.5 mL无菌离心管、1.5 mL无菌离心管(长臂型)、生理盐水、研钵、无菌

　　1mL, 2OOuL、10uL枪头、记号笔等。

　　【操作步骤】

　　一、样品造备

　　1、血液样品：抗凝血样品置离心管中，8000转/分钟离心2分钟，取上层血浆;非抗凝血样品置离心管中，待凝固后，8000转/分钟离心2分钟，取上层血清，置于灭菌离心管中，编号待检。

　　2、组织样品：采集脾脏、肝脏、淋趋附、扁桃体等病变组织样品0.1g.组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，参与1 mL生理盐水混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心骨中，编号待检。

　　3、口腔液：进食前用拭子/口腔液采集袋或自造棉线绑纱布团吸哄动物品味，网络口腔液大于 500uL， 8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检。

　　4、饲料：取适量研磨后的饲料(约0.2g)，放入含1 mL生理盐水或PBS(PH为7.4)缓冲液的2 mL EP 管屮，振荡混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中,编号待检.

　　5、尘埃：用无菌棉签蘸取适量环境表表上的尘埃，放入含1 mL生理盐水或PBS(PH为7.4)缓冲液的2 mL EP管中，振荡混匀，8000转/分钟离心2分钟，取上清于灭菌离心管中，编号待检。

　　二、DNA的提取

　　1、取裂解液200uL参与无核酸酶1.5 mL离心曾屮，别离参与血浆/血清/组织液等样品液200uL. 震荡混匀10秒或颠倒混匀10次，室温搁置5分钟(若是室内温度较低时.需搁置25C水浴温育)，再参与200uL无水乙醇，颠倒混匀10秒;若样品浑浊则先12000转/分钟离心1分钟处置，取上清液，以预防梗塞柱子;

　　2、将液体转入套有网络管的吸附柱中， 12000rpm离心1分钟：

　　3、弃网络管液体，向吸附柱中加600uL洗液I , 12000 rpm离心1分钟;

　　4、弃网络管液体，向吸附柱中加600uL洗液II， 12000 rpm离心I分钟;

　　5、弃网络管液体，12000 rpm离心2分钟，以*去除残留洗液;

　　6、将吸附柱转入新的无核酸酸1.5mLEP管(长臂型)中，向柱中央滴加50 uL洗脱液，静置1分钟, 12000 rpm离心1分钟，EP管中液体即为病毒DNA。

　　【当苦衷项】

　　1、尝试前诺仔细阅读本试剂盒说明书，严格依照操作步骤执行.在操作过程中对功夫、试剂体积等粘确节造能够获得好的了局。

　　2, 样本应新鲜采集使用，或低温运输贮存;

　　3, 样本拥有潜在习染风险，核酸的提取应在核酸提取尝试室的生物安全柜中进行。

　　4、核酸提取冇关耗材确保高温灭菌，提取后核酸尽快进入下一步试验或冷冻保留待用。

　　5, 试剂使用前应混合均匀，试剂拥有肯定侵蚀性，使用时请戴手套、口zhao做好防护。

　　6. 低温下裂解液出现结晶数属正常景象，可在60°C水浴加热助溶后使用。

　　7、尝试产生的拔除物应实时网络，远离PCR尝试室进行无害化处置。

　　仅供兽医诊断使用

　　非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明书

　　【兽药名称】

　　通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒

　　汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

　　英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

　　商品名称：无

　　【重要成分与含量】试剂盒中含有如下组分:

试剂盒组分	含量
阳性对照	250μL/管×1管
阴性对照	250μL/管×1管
PCR反映液	850μL/管×1管
萌混合液	150μL/管×1管
说明书	1份/盒
【作用与用处】本试剂盒可用于血液、脾脏、肝脏、淋趋附、样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。扁桃体、肾脏、肌肉、环境样品等

　　【用法与判定】

　　1 用法

　　1.1待检样品釆集、保留及运输

　　1.1.1样品釆集

　　(1) 活猪样品无菌采集抗凝血或血清5mL

　　(2) 病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋趋附、肌肉等组织样品。2?8°C低温运至尝试室用于检测。

　　(3) 病猪传染的周边环境采集与病猪有关场所的粪便、饲料、污水样品。2?8°C低温运至尝试室用于检测。

　　1.1.2样品保留采集的样品在2?8°C保留应不超过24幼时，-70°C前提下保留，预防反复冻融。

　　1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进走运输。包装和运输应切合农业村落部《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样品运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输治理的有关划定。

　　1.2样品处置

　　1.2.1血液样品处置抗凝血样品置于离心管中，8000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号待检。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟取200μL上层血清，编号待检。

　　1.2.2组织样品处置取适量脾脏、肝脏、淋趋附、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，再加适量生理盐水混匀，造成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。

　　1.2.3环境样品处置

　　1.2.3.1粪便、饲料样品处置步骤取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨混匀，造成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。

　　1.2.3.2污水样品处置步骤直接取200μL污水进行核酸提取。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法进行DNA核酸提取。

　　1.4荧光PCR反映：

　　1.4.1从试剂盒中取出荧光PCR反映液、酶混合液，室温消融后，2000 r/min离心5秒。设被检样品、阳性对照和阴性对照总和为n,则反映系统配造如下：

　　试剂系统

　　PCR 反映液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml离心管中参与上述试剂，充分混匀后瞬时离心。依照20μL/ 管分装量将试剂分装至荧光PCR反映管。

　　1.4.3在上述造备好的荧光PCR反映管平别离参与阴性对照、阳性对照各5μL、处置好的待测核酸各5μL,终体积25μL/管，盖好荧光PCR反映管盖，混匀后瞬时离心，转移到荧光PCR仪器上。

　　144将PCR反映管搁置在荧光PCR仪样品槽中，在荧光PCR仪上运行以下法式：

步骤	前提	循环数
UNG处置	50 ℃, 2分钟	1
预变性	95 ℃, 3分钟	1
预扩增	95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒	5
PCR扩増	95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒	40

　　荧光通路选择FAM,在PCR扩增阶段每个循环的55℃时采集荧光信号。设置扩增系统为25μL, 同时要选择passive reference和quencher为none的模式。(注：若荧光PCR仪(如AB17500)按注明书中的反映法式设置后因持温功夫短无法运行，可将预扩增和PCR扩增前提调换为95C： 5秒 55°C： 30 秒)

　　2了局判定

　　2.1试验有效性判定

　　阳性对照有典型扩增曲线且Ct值≤30.且阴性对照无Cl值或无扩增曲线，线形为直线或轻微斜线，无指数增。则判试验了局有效。不然，这次试验视为无效。

　　2.2样品判定

　　2.2.1阳性：样本检测了局Ct值≤35且有显著指数增，判定检出非洲猪瘟病毒核酸。

　　2.2.2可疑：样本检测了局Ct值在35?38领域内。此时应对样本进行沉复检测，若是沉复尝试了局Ct值仍在35?38领域内，有显著指数增.则判定为阳性，不然为阴性。

　　2.2.3阴性：样本检测了局Ct值>38或无Ct值，判定未检出非洲猪瘟病毒核酸。

　　【当苦衷项】(1)尝试前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格依照操作步骤执行，在操作过程中对功夫、试剂体积等节造能够获得好的了局。

　　(2) 尝试室应严格依照有关划定分区治理，遵循配液区-模板提取区-扩增区-分析区挨次进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。

　　(3) 核酸提取有关耗村确保干净、无DNase/RNase,提取过程尽量低温、急剧，实现后进入下一步尝试或冻保。

　　(4) 对于顶部采光仪器要带新的一次性PE手套对荧光PCR管封盖，对于底部采光仪

　　器要预防徒手或使用过的手套接触荧光PCR管底，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。